Titolo del progetto

PROGETTO 1 – Ruolo della pentrassina lunga PTX3 nell’osteomielite – Attività nel 2020.

Il progetto è sviluppato presso la Fondazione Humanitas per la Ricerca (ICH), assieme all’Istituto di Ricerca Generica e Biomedica del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) presso ICH.

Stato dell’arte e razionale dello studio. L’osteomielite è un’infezione ossea debilitante spesso causata dal batterio Staphylococcus aureus (SA). Con l’aumentare del numero di ceppi batterici resistenti agli antibiotici e delle procedure chirurgiche per impianto e sostituzione di protesi articolari, nonché in considerazione dell’invecchiamento progressivo della popolazione, urgente è la domanda di nuovi approcci profilattici e terapeutici al trattamento di questa infezione. La pentrassina lunga PTX3 è un mediatore solubile dell’immunità innata che svolge ruoli essenziali nella protezione dell’ospite da microrganismi patogeni. Notevole è inoltre il suo potenziale quale biomarcatore diagnostico e prognostico nella sepsi, ivi comprese le infezioni da ceppi di SA meticillino resistenti (MRSA).

Ipotesi dello studio. Recentemente è stato dimostrato che il deficit genetico di PTX3 in animali sperimentali è associato ad una ridotta formazione della matrice ossea durante il rimodellamento fisiologico di questo tessuto e la sua rigenerazione dopo frattura; ciò suggerisce che PTX3 svolga un ruolo importante nel turn-over della matrice ossea. Sulla base di tali evidenze e delle funzioni che PTX3 esercita nelle infezioni opportunistiche e nella sepsi, si è ipotizzato che questa pentrassina sia coinvolta nell’eziopatogenesi dell’osteomielite.

Obiettivi generali e risultati attesi. Questo progetto di ricerca si propone di investigare il ruolo di PTX3, quale paradigma dell’immunità innata umorale all’interfaccia con la matrice ossea, nell’osteomielite da SA. E’ atteso che questo studio generi nuove ipotesi meccanicistiche in osteoimmunologia e fornisca indicazioni originali su modalità innovative di trattamento dell’osteomielite.

Obiettivi specifici al secondo anno (Dicembre 2020). Gli obiettivi del secondo anno, conclusosi il 31 dicembre scorso, sono stati:

  1. valutazione degli outcome primari (infezione) e secondari (morfometria, istologia, citologia e infiammazione) di un modello animale (murino) di infezione locale (nel femore) da SA (descritto nella Relazione annuale 2019) che ricapitola l’osteomielite da chirurgia e/o trauma nell’uomo e consente di studiare il ruolo patogenetico di PTX3 in vivo

  2. ulteriore sviluppo di modelli sperimentali 3D in vitro che riproducano il microambiente dell’osso in condizioni di infezione da SA e consentano di apprezzare il ruolo di PTX3, quali strumenti di verifica e/o sviluppo di ipotesi meccanicistiche.

      3. valutazione del potenziale di PTX3 quale biomarcatore per la diagnosi delle infezioni articolari periprotesiche.

Piano sperimentale dello studio. Il perseguimento degli obiettivi progettuali precedentemente elencati ha richiesto una pianificazione delle attività sperimentali su livelli multipli come di seguito dettagliato:

Piano sperimentale dell’obiettivo 1: infettare (per via intra-femorale) topi wild type (WT) e geneticamente modificati (PTX3 deficienti, o KO) con SA, e monitorare l’evoluzione della patologia scheletrica in termini di carica microbica, parametri sierologici, immunologici, osteologici e morfometrici. 

Piano sperimentale dell’obiettivo 2: ottimizzare le condizioni di coltura di cellule MC3T3 (linea murina pre-osteoblastica) e SA su scaffold ossei biomimetici di nuova concezione, e definire protocolli di estrazione di mRNA da cellule MC3T3 adese allo scaffold con l’obiettivo di valutare l’espressione di geni di interesse nel corso dell’infezione. 

Piano sperimentale dell’obiettivo 3: analisi dei dati generati nell’ambito di uno studio diagnostico coordinato dal dott. Mattia Loppini (Medico Assistente presso l’Unità di Ortopedia dell’Anca e Chirurgia Protesica di ICH) e dalla dott.ssa Barbara Bottazzi (Responsabile del Laboratorio di Immunofarmacologia di ICH) in cui sono stati arruolati soggetti con protesi d’anca o ginocchio e sospetta infezione periprotesica, sottoposti a chirurgia di revisione. In questi soggetti è stata misurata la concentrazione di PTX3 nel plasma e nel liquido sinoviale e ne è stata valutata l’associazione con la presenza di infezione ed il suo grado di severità.

Metodologia applicata. Le attività indicate sono state svolte applicando una strategia sperimentale interdisciplinare che combina tecniche e metodologie della microchirurgia, della microbiologia e dell’immunologia molecolare e cellulare, dell’imaging nel piccolo animale e della diagnostica clinica.

Obiettivo 1. Topi C57Bl/6 WT e PTX3 KO maschi di circa 8 settimane sono stati infettati mediante iniezione di SA nella cavità midollare del femore destro; in parallelo, secondo la stessa procedura un analogo gruppo di animali è stato inoculato con il solo veicolo (PBS), come controllo. Gli animali sono stati assegnati all’uno o all’altro gruppo di trattamento in modo random e monitorati allo scopo di rilevare l’insorgenza di eventuali segni di sofferenza, in particolare difficoltà nella deambulazione e zoppia. Sono stati effettuati prelievi dalla vena caudale al giorno dell’infezione e, successivamente, ogni 3/4 giorni per valutare l’andamento dei livelli circolanti di citochine infiammatorie (mediante tecniche ELISA). Al 16° giorno, gli animali sono stati sacrificati per il prelievo di sangue ed organi. Al sacrificio sono state prelevate le ossa degli arti inferiori al fine di misurarne la carica batterica mediante conta delle CFU (Colony Forming Units, ovvero numero di batteri vivi) ed effettuarne valutazioni istochimiche (su sezioni di tessuto). La carica batterica negli arti inferiori è stata, inoltre, valutata a tempi brevi (6° giorno dall’infezione), allo scopo di caratterizzare l’andamento locale dell’infezione. In ulteriori esperimenti, si è proceduto al prelievo del midollo osseo (al fine di determinarne la composizione cellulare mediante tecniche citofluorimetriche) ed alla preparazione del tessuto muscolo-scheletrico per analisi morfometriche (mediante tecniche microCT, micro computed tomography). Con l’obiettivo di valutare la disseminazione dell’infezione ad altri organi e tessuti sono state effettuate analisi citofluorimetriche della milza e microbiologiche del fegato.

Obiettivo 2. In riferimento alle attività sperimentali in vitro, cellule MC3T3 e batteri (SA) sono stati singolarmente incubati con scaffold biomimetici (prodotti presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici del CNR di Faenza) e ne sono state monitorate adesione e proliferazione mediante quantificazione del DNA genomico con tecnica Picogreen e conta dei batteri vivi (CFU), con l’obiettivo di ottimizzare le condizioni di coltura per successivi studi di infezione in modalità 3D sulle stesse matrici. Sono stati, inoltre, sviluppati protocolli di estrazione di mRNA da cellule MC3T3 adese allo scaffold allo scopo di isolare mRNA in quantità e qualità sufficienti a valutare l’espressione di geni di interesse (possibilmente con approcci olistici del tipo RNA sequencing) nel corso dell’infezione.

Obiettivo 3. In relazione alle attività cliniche svolte nell’ambito del progetto, sono stati elaborati ed analizzati i dati generati in uno studio diagnostico dal titolo “Studio osservazionale monocentrico di accuratezza diagnostica della proteina pentrassina 3 ematica e sinoviale per la diagnosi di infezione periprotesica di anca e ginocchio”. In questo studio sono stati arruolati 126 soggetti con protesi d’anca o ginocchio e sospetta infezione periprotesica, sottoposti a chirurgia di revisione parziale o totale. In questi soggetti è stata misurata la concentrazione della proteina PTX3 nel plasma e nel liquido sinoviale mediante tecnica ELISA. Ciò ha consentito di valutare la potenza diagnostica (in termini di sensibilità e specificità) di PTX3 quale marcatore di infezione e correlarne i livelli con virulenza del patogeno/grado di infezione, sia individualmente che in combinazione con marcatori in uso nella pratica clinica corrente (CRP, VES e d-dimero).

Considerazioni statistiche. I dati ottenuti sono stati analizzati usando test statistici non-parametrici allo scopo di valutare l’effetto del genotipo sull’infezione ossea nonché sui parametri sierologici ed immunologici misurati.

Conclusioni al termine del secondo anno. I risultati ottenuti in questa seconda fase dello studio, in combinazione e ad integrazione di quelli generati nel primo anno, indicano che il deficit genetico di PTX3 protegge dall’infezione da SA quando il patogeno è iniettato direttamente nella cavità midollare del femore di animali sperimentali (topi), condizione che mima l’osteomielite da chirurgia e/o trauma nell’uomo. In particolare, è stato osservato che gli animali PTX3 deficienti mostrano una notevole riduzione della carica batterica nell’arto infetto e presentano, in generale, sintomi di sofferenza più lievi rispetto agli animali WT. In linea con queste osservazioni, la risposta infiammatoria è più accentuata negli animali WT SA rispetto a quelli PTX3 KO SA, in termini di espansione del compartimento leucocitario (monociti/macrofagi e PMN) nella milza.

Inoltre, l’effetto protettivo associato al deficit di PTX3 è evidente già a 6 giorni dall’infezione con SA. Quest’ultima evidenza suggerisce che PTX3 svolga un ruolo importante nelle fasi iniziali dell’infezione, quando i meccanismi di adesione, formazione di biofilm ed ascessi messi in atto da SA svolgono un ruolo dominante. Questi processi saranno studiati e caratterizzati in futuri esperimenti in vivo ed in vitro. Inoltre, sono state ottimizzate le condizioni sperimentali per i) coltivare cellule MC3T3 ed SA su scaffold ossei biomimetici ed ii) estrarre mRNA da cellule MC3T3 adese allo scaffold in quantità e qualità adeguate ad analisi trascrittomiche. Questi aspetti procedurali costituiscono un prerequisito fondamentale per la futura implementazione di co-colture MC3T3/SA in setting 3D quali modello in vitro di OM. 

Il dato più rilevante emerge dalla clinica, per cui la proteina PTX3 nel liquido sinoviale si configura quale marcatore diagnostico ad elevata specificità di infezione periprotesica. Sulla scia di queste evidenze, è stato elaborato un nuovo protocollo di studio che prevede di integrare i dati clinici e biochimici disponibili dalla stessa coorte di pazienti con informazioni di natura genetica. Questo studio, dal titolo “Identificazione di biomarcatori genetici della suscettibilità all’infezione periprotesica di anca e ginocchio e della severità di patologia”, si propone di valutare l’associazione tra polimorfismi a singola base (SNPs) presenti nel gene PTX3 e l’incidenza di infezione periprotesica dell’anca e del ginocchio in pazienti sottoposti a chirurgia di revisione. Esso sarà coordinato dal dott. Loppini (quale responsabile clinico) e dal dott. Inforzato e dalla dott.ssa Sobacchi (quali responsabili scientifici). Si fa presente che il relativo protocollo ha già superato la fase di valutazione formale presso il Comitato Etico Indipendente di ICH, la cui valutazione di merito è attesa per Febbraio/Marzo 2021.

Pubblicazioni. Le pubblicazioni dei ricercatori del progetto, nel corso di questo anno sono stati:

  1. Stravalaci M, Davi F, Parente R, Gobbi M, Bottazzi B, Mantovani A, Day AJ, Clark SJ, Romano MR, Inforzato A. (2020) Control of Complement Activation by the Long Pentraxin PTX3: Implications in Age-Related Macular Degeneration. Front Pharmacol. 11:591908.

  2. Parente R, Doni A, Bottazzi B, Garlanda C, Inforzato A. (2020) The complement system in Aspergillus fumigatus infections and its crosstalk with pentraxins. FEBS Lett. 594(16):2480-2501. 

  3. Magrini E, Di Marco S, Mapelli S, Perucchini C, Pasqualini F, Donato A, de la Luz Guevara Lopez M, Carriero R, Ponzetta A, Colombo P, Cananzi F, Supino D, Reis ES, Peano C, Inforzato A, Jaillon S, Doni A, Lambris JD, Mantovani A, Garlanda C. (2020) Complement activation promoted by the lectin pathway mediates C3aRdependent sarcoma progression and immunosuppression. Nature Cancer [in press].
  4. Doni A, Parente R, Laface I, Magrini E, Cunha C, Colombo F, Lacerda J, Campos Jr A, Petroni F, Porte R, Inforzato A, Bottazzi B, Garlanda C, Botto M, Carvalho A, Mantovani A. (2020) Serum Amyloid P component is an essential element of resistance against Aspergillus fumigatus. Nat Commun. [in revision].

Partecipazione a Congressi. La partecipazione a congressi nel corso di questo anno sono state:

Partecipazione a bandi competitivi di finanziamento.  In considerazione dei dati incoraggianti prodotti nei primi due anni e dell’opportunità offerta dal bando PRIN (Progetti di ricerca di Rilevante Interesse Nazionale) 2020 del MUR (Ministero dell’Università e della Ricerca), una proposta di ricerca è stata redatta ed inviata al MUR per valutazione competitiva. Questa prevede un ventaglio di attività che spaziano da modellistica in vitro a sperimentazione animale e studi clinici, ed è strutturata secondo un approccio metodologico e tecnologico di tipo integrato e transdisciplinare. 

A tal proposito, è previsto lo sviluppo di nuove metodologie di miscroscopia ad alta risoluzione e sensibilità che consentiranno di valutare, in particolare, composizione e struttura delle diverse componenti della matrice ossea. Io studio proposto prevede il coinvolgimento di 5 unità (Dott.ssa Cristina Sobacchi, CNR; Dott. Antonio Inforzato, Humanitas University; Prof. Dario Polli, Politecnico di Milano; Prof. Tullio Scopigno, Università di Roma “La Sapienza”; Prof.ssa Antonella Mencacci, Università di Perugia).

Ulteriori attività scientifiche in collaborazione. Nell’alveo delle attività sperimentali in seno al progetto, è stata avviata una collaborazione con l’Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri” di Milano che prevede la caratterizzazione cinetica delle interazioni tra PTX3 e componenti selezionate del sistema del complemento allo scopo di fornire una cornice biochimica ad una delle ipotesi meccanicistiche circa il ruolo di PTX3 nell’osteomielite, ovvero la capacità di questa pentrassina di regolare l’attivazione del complemento, sistema chiave nella risposta immunitaria nativa alle infezioni.