Titolo del progetto

Il progetto è sviluppato presso la Fondazione Humanitas per la Ricerca (ICH), assieme all’Istituto di Ricerca Generica e Biomedica del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) presso ICH.

Stato dell’arte e razionale dello studio. L’osteomielite è un’infezione ossea debilitante spesso causata dal batterio Staphylococcus aureus (SA). Con l’aumentare del numero di ceppi batterici resistenti agli antibiotici e delle procedure chirurgiche per impianto e sostituzione di protesi articolari, nonché in considerazione dell’invecchiamento progressivo della popolazione, urgente è la domanda di nuovi approcci profilattici e terapeutici al trattamento di questa infezione. La pentrassina lunga PTX3 è un mediatore solubile dell’immunità innata che svolge ruoli essenziali nella protezione dell’ospite da microrganismi patogeni. Notevole è inoltre il suo potenziale quale biomarcatore diagnostico e prognostico nella sepsi, ivi comprese le infezioni da ceppi di SA meticillino resistenti (MRSA).

Ipotesi dello studio. Recentemente è stato dimostrato che il deficit genetico di PTX3 in animali sperimentali è associato ad una ridotta formazione della matrice ossea durante il rimodellamento fisiologico di questo tessuto e la sua rigenerazione dopo frattura; ciò suggerisce che PTX3 svolga un ruolo importante nel turn-over della matrice ossea. Sulla base di tali evidenze e delle funzioni che PTX3 esercita nelle infezioni opportunistiche e nella sepsi, si è ipotizzato che questa pentrassina sia coinvolta nell’eziopatogenesi dell’osteomielite.

Obiettivi generali e risultati attesi. Questo progetto di ricerca si propone di investigare il ruolo di PTX3, quale paradigma dell’immunità innata umorale all’interfaccia con la matrice ossea, nell’osteomielite da SA. E’ atteso che questo studio generi nuove ipotesi meccanicistiche in osteoimmunologia e fornisca indicazioni originali su modalità innovative di trattamento dell’osteomielite.

Obiettivi specifici. Nello specifico, questo studio è finalizzato a:

1. studiare il ruolo di PTX3 nell’eziopatogenesi dell’osteomielite da SA, e valutarne il potenziale profilattico e terapeutico in modelli pre-clinici di infezione ossea cronica da SA;
2. sviluppare modelli sperimentali 3D in vitro che riproducano il microambiente dell’osso in condizioni di infezione da SA e consentano di apprezzare il ruolo di PTX3, quali strumenti di verifica e/o sviluppo di ipotesi meccanicistiche;
3. investigare il potenziale di PTX3 quale biomarcatore per la diagnosi delle infezioni articolari periprotesiche.

Piano sperimentale dello studio. Il perseguimento degli obiettivi progettuali precedentemente elencati richiede una una pianificazione delle attività sperimentali su livelli multipli come di seguito dettagliato:

Piano sperimentale dell’obiettivo 1: infettare (per via intra-femorale) topi wild type (WT) e geneticamente modificati (PTX3 deficienti, o KO) con SA, e monitorare l’evoluzione della patologia scheletrica in termini di carica microbica, parametri sierologici, immunologici, osteologici e morfometrici. Queste attività sono svolte in collaborazione con la dott.ssa Cristina Sobacchi (IRGB).

Piano sperimentale dell’obiettivo 2: definire le condizioni di coltura di cellule MC3T3 (linea murina pre-osteoblastica) e SA su scaffold ossei biomimetici di nuova concezione, e definire protocolli di estrazione di mRNA da cellule MC3T3 adese allo scaffold con l’obiettivo di valutare l’espressione di geni di interesse nel corso dell’infezione. Queste attività vedono il coinvolgimento delle dott.sse Monica Sandri (Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici del CNR, ISTEC) ed Anna Tampieri (ISTEC ed Istituto per lo Studio dei Materiali Nanostrutturati del CNR, ISMN). 

Piano sperimentale dell’obiettivo 3: analisi dei dati generati nell’ambito di uno studio diagnostico coordinato dal dott. Mattia Loppini (Medico Assistente presso l’Unità di Ortopedia dell’Anca e Chirurgia Protesica di ICH) e dalla dott.ssa Barbara Bottazzi (Responsabile del Laboratorio di Immunofarmacologia di ICH) in cui sono stati arruolati soggetti con protesi d’anca o ginocchio e sospetta infezione periprotesica, sottoposti a chirurgia di revisione. In questi soggetti è stata misurata la concentrazione di PTX3 nel plasma e nel liquido sinoviale e ne è stata valutata l’associazione con la presenza di infezione ed il suo grado di severità.

Metodologia applicata. Le attività indicate sono state svolte applicando una strategia sperimentale interdisciplinare che combina tecniche e metodologie della microchirurgia, della microbiologia e dell’immunologia molecolare e cellulare, dell’imaging nel piccolo animale e della diagnostica clinica.

Conclusioni al secondo anno dello studio

1. Abbiamo messo a punto e standardizzato un modello sperimentale di infezione ossea nel topo necessario per studiare il ruolo di PTX3 nella patogenesi dell’osteomielite;
2. abbiamo messo a punto un modello sperimentale in vitro 3D di infezione da SA basato su uno scaffold osseo biomimetico, per lo studio della colonizzazione batterica dell’osso e degli effetti della proteina PTX3;
3. abbiamo osservato che elevati livelli di PTX3 nel liquido sinoviale predicono quali pazienti andranno incontro a infezione della protesi dell’anca. Misurare i livelli di PTX3 nel liquido sinoviale è di potenziale grande utilità clinica per individuare precocemente i pazienti ad alto rischio di infezione della protesi e poter quindi instaurare le terapie necessarie;
4. abbiamo dimostrato che in un modello murino di osteomielite da SA PTX3 aggrava la patologia mentre l’assenza di questa proteina si associa a una patologia meno grave, indicando quindi che il blocco farmacologico di PTX3 potrebbe rappresentare una nuova strategia terapeutica per il trattamento delle infezioni ossee.

Pubblicazioni. Le pubblicazioni dei ricercatori del progetto, nel corso di questo anno sono stati:

1. Stravalaci M, Davi F, Parente R, Gobbi M, Bottazzi B, Mantovani A, Day AJ, Clark SJ, Romano MR, Inforzato A. (2020) Control of Complement Activation by the Long Pentraxin PTX3: Implications in Age-Related Macular Degeneration. Front Pharmacol. 11:591908.
2. Parente R, Doni A, Bottazzi B, Garlanda C, Inforzato A. (2020) The complement system in Aspergillus fumigatus infections and its crosstalk with pentraxins. FEBS Lett. 594(16):2480-2501. 
3. Magrini E, Di Marco S, Mapelli S, Perucchini C, Pasqualini F, Donato A, de la Luz Guevara Lopez M, Carriero R, Ponzetta A, Colombo P, Cananzi F, Supino D, Reis ES, Peano C, Inforzato A, Jaillon S, Doni A, Lambris JD, Mantovani A, Garlanda C. (2020) Complement activation promoted by the lectin pathway mediates C3aRdependent sarcoma progression and immunosuppression. Nature Cancer [in press].
4. Doni A, Parente R, Laface I, Magrini E, Cunha C, Colombo F, Lacerda J, Campos Jr A, Petroni F, Porte R, Inforzato A, Bottazzi B, Garlanda C, Botto M, Carvalho A, Mantovani A. (2020) Serum Amyloid P component is an essential element of resistance against Aspergillus fumigatus. Nat Commun. [in revision].

Partecipazione a Congressi. La partecipazione a congressi nel corso di questo anno sono state:

Partecipazione a bandi competitivi di finanziamento.  In considerazione dei dati incoraggianti prodotti nei primi due anni e dell’opportunità offerta dal bando PRIN (Progetti di ricerca di Rilevante Interesse Nazionale) 2020 del MUR (Ministero dell’Università e della Ricerca), una proposta di ricerca è stata redatta ed inviata al MUR per valutazione competitiva. Questa prevede un ventaglio di attività che spaziano da modellistica in vitro a sperimentazione animale e studi clinici, ed è strutturata secondo un approccio metodologico e tecnologico di tipo integrato e transdisciplinare. 

A tal proposito, è previsto lo sviluppo di nuove metodologie di miscroscopia ad alta risoluzione e sensibilità che consentiranno di valutare, in particolare, composizione e struttura delle diverse componenti della matrice ossea. Io studio proposto prevede il coinvolgimento di 5 unità (Dott.ssa Cristina Sobacchi, CNR; Dott. Antonio Inforzato, Humanitas University; Prof. Dario Polli, Politecnico di Milano; Prof. Tullio Scopigno, Università di Roma “La Sapienza”; Prof.ssa Antonella Mencacci, Università di Perugia).

Ulteriori attività scientifiche in collaborazione. Nell’alveo delle attività sperimentali in seno al progetto, è stata avviata una collaborazione con l’Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri” di Milano che prevede la caratterizzazione cinetica delle interazioni tra PTX3 e componenti selezionate del sistema del complemento allo scopo di fornire una cornice biochimica ad una delle ipotesi meccanicistiche circa il ruolo di PTX3 nell’osteomielite, ovvero la capacità di questa pentrassina di regolare l’attivazione del complemento, sistema chiave nella risposta immunitaria nativa alle infezioni.