Titolo del progetto

Il progetto è sviluppato presso l’Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, nelle sedi di Milano e Bergamo.

Stato dell’arte e razionale dello studio. Il microambiente tumorale (TME), nelle sue componenti cellulari e molecolari, ha un ruolo determinante nella malattia oncologica, e in particolare nello sviluppo delle metastasi. Questa considerazione ha aperto la strada allo sviluppo di diversi strumenti terapeutici per alterare o “rieducare” il microambiente tumorale, con il fine ultimo di ostacolare la crescita dei tumori e delle metastasi.

Nello specifico, l’interazione delle cellule tumorali con cellule e molecole presenti nell’osso guida ogni fase del processo di formazione delle metastasi ossee, regolando la migrazione delle cellule tumorali alla sede ossea, la sopravvivenza delle cellule tumorali stesse che sfuggono al sistema immunitario, la proliferazione della nuova lesione, e infine l’attivazione di cellule deputate al rimodellamento osseo per formare lesioni osteolitiche o osteoblastiche.

È da sottolineare come le metastasi ossee rappresentino un problema medico importante in quanto molti tumori maligni umani, alcuni dei quali molto frequenti come quelli della mammella e della prostata, metastatizzano frequentemente all’osso. La presenza di metastasi ossee riduce fortemente la sopravvivenza e la qualità della vita di questi pazienti anche perché le terapie disponibili per contrastarle sono poco efficaci.  È quindi molto importante attuare della ricerca focalizzata allo studio delle metastasi ossee che ponga le basi per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le metastasi ossee.

Obiettivi generali del progetto.

Questo progetto si prefigge di studiare il microambiente (TME) della metastasi ossee per sviluppare nuovi approcci farmacologici che, agendo sul TME, possano inibire lo sviluppo e la progressione delle metastasi all’osso. 

Lo studio è stato suddiviso in due sottoprogetti: 

1. modulazione farmacologica dei macrofagi del microambiente metastatico per l’acquisizione di un fenotipo antitumorale che inibisca l’attecchimento e la progressione tumorale metastastica.
2. analisi del ruolo della TSP-1 nello sviluppo di metastasi ossee osteolitiche e identificazione di specifici domini con potenziale attività antimetastatica come base per nuovi approcci terapeutici.

Sottoprogetto 1. Modulazione farmacologica dei macrofagi del microambiente metastatico per l’acquisizione di un fenotipo anti-tumorale che inibisca la progressione tumorale.

Stato dell’arte e razionale. Il sistema immunitario (SI) è composto da elementi cellulari e fattori che condizionano l’organismo umano sia in stato di salute che in malattia. Il SI si divide in due parti: una “immunità innata” (aspecifica ed immediata) ed un’altra “adattativa” (antigene specifica e di memoria) che, essendo interconnesse, si supportano e regolano a vicenda. Ad oggi, la modulazione del sistema immunitario ad uso terapico è sempre più radicata in clinica oncologica con risultati incoraggianti.

In generale, l’immunità anti-tumorale comporta la cattura e l’elaborazione degli antigeni tumorali da parte delle cellule presentanti l’antigene (APC) e la loro presentazione alle cellule T in modo da innescare la risposta adattativa; in seguito, i linfociti T migrano verso il tumore per esercitare specifici effetti antitumorali. Le APC giocano quindi un ruolo chiave nella risposta immunitaria e sono di due tipi: i macrofagi (MΦ) che sono residenti tissutali e che possono assumere fenotipo sia M1 (immunostimolante, anti-tumorale) che M2 (immunosoppressivo, tolerogenico), e le cellule dendritiche (DC) che hanno la capacità di migrare e indurre una risposta specifica esercitata dal sistema immunitario adattativo. I MΦ svolgono un ruolo essenziale per l’inizio e la progressione tumorale e metastatica condizionando quindi la prognosi della malattia; quelli associati al tumore sono denominati TAM e possono modificare il microambiente tumorale (TME) che, generalmente, promuove un fenotipo immunosoppressivo attraverso meccanismi molecolari e fattori che inibiscono l’attività delle cellule immunitarie.  Ad oggi modulare il TME ed il fenotipo delle APC rappresenta un passo per lo sviluppo di un nuovo approccio per l’immunoterapia contro diverse tipologie tumorali e cancro.

Ipotesi dello studio. La nostra strategia d’azione punta alla rieducazione funzionale dei macrofagi MΦ e M2 del TME verso un profilo M1; tale switch sposterà l’equilibrio del TME che favorisce la crescita della massa metastatica risvegliando una risposta immunitaria antitumorale finalizzata ad una riduzione delle metastasi ossee. 

A tal fine, è stata individuata una classe di farmaci agonisti dei recettori Toll-like receptors (TLRs) come possibili candidati. Questi recettori sono espressi dalle cellule target ma per evitare il loro effetto sui macrofagi di altri tessuti verranno generati, in collaborazione con il Politecnico di Milano, sistemi di delivery mirata evitando l’effetto sistemico indesiderato. Inoltre tali farmaci sono già stati approvati dalla Food and Drug Administration agency (FDA), che consentirebbe una più veloce applicabilità in clinica.

Obiettivi generali :

• Studi in vitro su macrofagi murini ed umani isolati o generati da materiale murino e umano, per determinare l’efficienza dei trattamenti          farmacologici mediante analisi molecolari e fenotipiche.
• In collaborazione con il Politecnico di Milano, generazione di nanoparticelle biocompatibili (NPs) che consentano la delivery selettiva dei farmaci all’osso per condizionare i macrofagi del TME. Allo stesso tempo, tale strategia verrà messa a confronto con costrutti di farmaci legati ai bifosfonati, i quali verranno sfruttati come agenti carrier dato il loro elevato tropismo osseo. 
• Studi in vivo su modelli animali di metastasi ossee per analizzare l’attività dei farmaci immunomodulanti e validare la migliore strategia di delivery farmacologica.
• In collaborazione con il Politecnico, studi per la produzione di un modello simil-fisiologico di scaffold osseo mediante stampa 3D per analisi farmacologiche e di interazione cellulare.

Gli obiettivi raggiunti del primo anno

1. Messa a punto della metodica di isolamento e coltura di macrofagi (cellule primarie differenziate) isolate da materiale murino ed umano.
2. Attivazione della convenzione per la cessione di emocomponenti con l’ASST Rhodense per l’isolamento di precursori macrofagici ed altre popolazioni del sistema immunitario umano per studi in vitro.
3. Studi su macrofagi in vitro la capacità immunomodulante dei farmaci presi in esame tramite analisi di espressione genica e di molecole di superficie.
4. Sviluppo di varie formulazioni di nanoparticelle cariche e di costrutti con i bifosfonati con conseguenti test di stabilità in media e plasma.

Sottoprogetto 2. Ruolo della TSP-1 nello sviluppo di metastasi ossee osteolitiche e identificazione di specifici domini con potenziale attività anti-metastatica come base per nuovi approcci terapeutici.

Stato dell’arte e razionale. Lo progetto è basato sulla nota capacità della trombospondina-1 (TSP-1) di organizzare il microambiente tumorale e coordinare la risposta delle cellule a variazioni delle proprietà del microambiente. Grazie alla sua struttura modulare, infatti, la TSP-1 lega un gran numero di molecole, compresi fattori coinvolti nella formazione di metastasi e nel rimodellamento dell’osso. Sulla base di questa evidenza e del ruolo che la TSP- 1 svolge nello sviluppo di metastasi ad altri organi, si è ipotizzato che questa proteina possa avere un ruolo nel regolare lo sviluppo di metastasi ossee osteolitiche.

Obiettivi specifici del secondo anno

Sulla base dei risultati ottenuti nel primo anno di studio, per il secondo anno ci siamo proposti di:

1. Definire il meccanismo di azione del frammento di TSP-1 attivo nell’inibire la formazione di metastasi osteolitiche, analizzando la sua attività a livello di cellule tumorali e di cellule del microambiente osseo
2. Identificare il dominio attivo all’interno del frammento.
3. Definire le proprietà del legame del frammento attivo a molecole implicate nella formazione delle metastasi ossee e nel rimodellamento della matrice ossea.

Approcci sperimentali

Obiettivo 1: valutare l’attività del frammento ricombinante su alcune funzioni delle cellule tumorali necessarie per il processo di formazione delle metastasi ossee (proliferazione, migrazione), e sul differenziamento e attività delle cellule deputate al rimodellamento dell’osso.

Obiettivo 2: produrre e analizzare frammenti ricombinanti a minore peso molecolare corrispondenti ai diversi domini funzionali presenti all’interno del frammento attivo della TSP-1. 

Obiettivo 3: analizzare le proprietà di legame dei frammenti di TSP-1 a recettori e fattori solubili implicati nel differenziamento e attività delle cellule responsabili del rimodellamento dell’osso (saggi di legame su fase solida e mediante Risonanza Plasmonica di Superficie) .

Conclusioni per il secondo anno della ricerca

L’attività di ricerca nel 2020 è stata inevitabilmente rallentata dall’emergenza sanitaria in corso. Tuttavia, sono stati fatti importanti progressi sia nello studio precedentemente avviato (sottoprogetto 2) che nell’acquisizione dei primi dati sull’effetto dei farmaci agonisti dei TLRs sulla polarizzazione dei macrofagi (sottoprogetto 1). Inoltre, sono stati messi a punto metodiche, modelli sperimentali e reagenti (compresi i domini ricombinanti della TSP-1, coniugati e nanoparticelle, e matrici sintetiche per modelli 3D) che saranno la base per gli studi nel prossimo anno per entrambi i sottoprogetti.

Sottoprogetto 1. I risultati ottenuti nei mesi di lavoro hanno delucidato quale dose degli agonosti dei TLRs è in grado di indurre lo switch di fenotipo nei macrofagi indifferenziati M0 e quelli M2 verso un fenotipo M1. La messa a punto del metodo ed il raggiungimento poi di questo risultato aprono la strada ai successivi e fondamentali steps per la sperimentazione di questo nuovo approccio farmacologico su modelli animali per le metastasi ossee. A questo scopo sono state formulate nanoparticelle in grado di incapsulare il farmaco e su cui sono in corso le dovute prove di stabilità e biocompatibilità prima dell’impiego in vivo su modelli di metastasi ossee.

Sottoprogetto 2. I risultati ottenuti quest’anno indicano due possibili meccanismi dell’azione antimetastatica del frammento attivo della TSP-1, che può agire sia sulle cellule tumorali che sulle cellule del microambiente osseo. In generale, i dati generati finora confermano le ipotesi originali dello studio, cioè la potenzialità di molecole basate su domini attivi della TSP-1 e di agenti che alterano il grado di polarizzazione dei macrofagi come strategie terapeutiche per agire sul microambiente per bloccare la progressione delle metastasi ossee.

Pubblicazioni

Carminati L, Taraboletti G. Thrombospondins in bone remodeling and metastatic bone disease. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Dec 1;319(6):C980-C990. doi: 10.1152/ajpcell.00383.2020.

Nastasi C, Mannarino L, D’Incalci M. – DNA Damage Response and Immune Defense. International Journal of Molecular Sciences. 2020; 21(20):7504, doi: 10.3390/ijms21207504.

Presentazioni e Congressi.

Due abstract sono stati inviati a congressi per presentare i risultati ottenuti. Per la pandemia di COVID-19, i due congressi sono stati rimandati al 2021 e 2022.

Carminati L, Sangalli F, Borsotti P, Pinessi D, Broggini M, Taraboletti G. Investigating the role of thrombospondins in bone remodeling and metastasis. European Association for Cancer Research, EACR 2020, Torino (postponed to 09-12 June 2021) .

Carminati L, Sangalli F, Borsotti P, Pinessi D, Broggini M, Taraboletti G. Modeling osteolytic bone metastasis to investigate the role of thrombospondins. Matrix Biology Europe 2020, Florence (postponed to 2022)